Selasa, 25 Oktober 2011

ANTHRACOID

1.1.1. Visualisasi kapsul

B. Anthracis berkapsul virulen terdapat di jaringan dan darah dan cairan tubuh lain dari hewan yang te;ah mati karena Anthrax dapat dilihat pada preparat ulas dari sepesimen tersebut yang telah dikeringkan, difixasi dan diwarnai dengan polychrome methylene blue (MçadyeanÃÔ reaction). Kapsul terwarnai pink sementara sel bacillus terwarnai biru tua. Sel-selnya terlihat berpasang-pasangan, atau rangkaian pendek. Pewarnaan Gram dan Giemsa tidak dapat mendeteksi kapsul. Kapsul tidak terdapat pada B. anthracis yang tumbuh dalam kondisi aerobic dalam nutrient agar atau nutrient broth. Alternatifnya kapsul dapat diproduksi ketika B. anthracis ditumbuhkan pada nutrient agar yang mengandung 0,70% sodium bicarbonate dan diinkubasi dalam 20% CO2.

Polychrome methylene blue dibuat dengan cara sebagai berikut: 0,30 gram methylene blue dilarutkan dengan 30 ml 95% ethanol. 100 ml KOH 0,01% dicampur dengan larutan methylene blue. Idealnya MçadyeanÃÔ stain ini harus dibiarkan kontak dengan udara dengan digoyang-goyang sesekali selama paling tidak 1 tahun untuk mengoksidasi dan mematangkan. Penambahan K2CO3 (untuk konsentrasi akhir 1%) akan mempermudah pematangan pewarnaan. Preparat ulas yang diperlukan hanya satu tetes darah atau cairan jaringan yang diulaskan secara tipis. l) larutanmSetelah difiksasi dan dikeringkan, satu tetes kecil (20 p[ewarna diteteskan pada preparat ulas dan diratakan dengan loop. Setelah satu menit dicuci dengan air ke dalam larutan hypochlorite (ada 10.000 ppm chlorine). Slide diblot, dikeringkan dan diobservasi dengan oil immersion (x1000) untuk melihat adanya kapsul pink yang mengelilingi bacilli yang berwarna biru/hitam. Untuk menghindari kontaminasi laboratorium, slide dan kertas blotting harus diautoclave atau di didesinfeksi dengan hypochlorite.

1.1.2. Pembiakan dan identifikasi B. anthracis

B. anthracis tumbuh pada hampir semua tipe Nutrient Agar, akan tetapi 5 s/d 7% Sheep Blood Agar atau Horse Blood Agar merupakan medium diagnostik pilihan. Darah adalah merupakan material klinis utama untuk diuji. Sweb darah atau cairan tubuh lainnya atau sweb yang diambil dari jaringan atau organ yang terserang dapat ditumbuhkan pada blood agar. Setelah inkubasi selama 1 malam (overnight) pada suhu 37 oC, coloni B. anthracis berwarna putih atau abu-abu keputihan dengan diameter 0,3 – 0,5 mm, non haemolitik dengan permukaan basah ground-glass, dan sangat lengket ketika di ambil dengan loop. Ciri-ciri ini disebut sebagai ÅÎedusa head¡¦ Untuk mengidentifikasi B. anthracis dapat diikuti dengan uji untuk diagnosa phage gamma dan kerentanan terhadap penicillin dan induksi kapsul. Uji ada tidaknya motility merupakan uji tambahan yang dapat dilakukan.

Prosedur uji kerentanan B. anthracis terhadap bakteriophage gamma sebagai berikut; streak platte blood agar atau Nutrient agar dengan organisme tersebut dan teteskan 10 ¡¦5 ul larutan phage pada 1 tempat yang di streak. Petri dish yang mengandung 10 unit penicillin ditempatkan di arah yang berbeda. Biarkan tetesan suspensi phage masuk kedalamnya dan inkubasi pada suhu 37 oC. Biakan kontrol harus dimasukkan, untuk itu menggunakan strain vaksin . setelah diinkubasi beberapa jam jika biakan itu B. anthracis daerah dibawah phage akan terhindar dari tumbuhnya Bakteri akibat lysisnya B. anthracis, dan zona terang akan terlihat mengelilingi petri dish yang mengandung penicillin.

Pendahuluan.
Anthrax merupakan penyakit yang bersifat zoonotik, disebabkan oleh Bacillus anthracis. Anthrax berasal dari bahasa Yunani yang berarti batu bara. Pemberian nama tersebut erat kaitannya dengan anthrax bentuk kulit dengan manifestasi klinis berupa luka yang berwarna kehitaman. Beberapa nama lain penyakit tersebut antara lain: Milzband (German); Charbon (Perancis); Malignant pustula; Malignant carbuncle; Splenic fever; Woolsorter’s disease; dan Radang llimfa.
Beberapa alasan yang mendasari penyakit anthrax menjadi penting dan strategis karena: kemampuan menular yang tersifat zoonotik, bakteri mampu membentuk spora yang mempunyai ketahanan tinggi di lingkungan, sehingga sulit dieradikasi. Pandangan umum anthrax identik dengan kematian menyebabkan kepanikan tersendiri. Dewasa ini penyakit anthrax semakin populer karena dapat digunakan sebagai senjata biologis.

Etiologi dan Kulturil.

Bacillus anthracis ditemukan tahun 1849 oleh Davaine dan Bayer, dan pada tahun 1855 diidentifikasi oleh Pollender. Braver pada tahun 1857, mampu mendemonstrasikan pemindahan penyakit anthrax dengan melakukan inokulasi darah hewan yang terinfeksi anthrax. Pada tahun 1877, Robert Koch mampu membuat biak murni Bacillus anthracis, membuktikan kemampuan bakteri tsb membentuk endospora dan mengenali lebih lanjut sifat-siat bakteri anthrax tersebut.
B.anthracis tersifat sebagai gram positif, non motil, bentuk batang yang berukuran besar 1-1,3 X 3-10 mikron meter, dengan ke-empat sudutnya membentuk siku-siku. Bakteri anthrax mampu membentuk spora, bentuk oval, yang berukuran 0,75 X 1,0 mikron meter. Adanya spora tersebut tidak menyebabkan pembengkaan sel. Sel vegetatif bakteri dilengkapi kapsula yang erat kaitannya dengan virulensi bakteri anthrax.
Sampel isolasi yang utama adalah darah dan jaringan limfe, tetapi swab eksret lubang alami tubuh dapat juga digunakan. Sampel isolasi juga bisa diambil dari tanah, tulang, dendeng, kulit dan sisa-sisa hewan tersangka atapun material yang diduga tercemar bakteri tersebut. B.anthracis mudah dikultur, baik menggunakan media biasa seperti: plat agar, kaldu nutrisi maupun media yang diperkaya dengan serum ataupun darah. Kisaran suhu pertumbuhan bakteri B.anthracis cukup luas, antara 12 0 C sampai 44 0 C, tetapi suhu optimumnya adalah 37 0 C. Inkubasi dilakukan selama 24 sampai 48 jam pada kondisi aerobik maupun anaerobic. Pertumbuhan bakteri anthrax pada media PAD tidak teramati sifat hemolitik, bilamana ada biasanya hemolisis lemah, membentuk koloni kasar berwarna putih keabu-abuan, dan mempunyai tepi koloni tidak beraturan. Pada perbesaran lemah terlihat sebagai rambut yang terurai atau dikenal sebagai caput medusa. Bentuk koloni tersebut disebabkan bakteri anthrax membentuk formasi rantai panjang dan tersusun secara pararel. Kultur yang bertujuan untuk mengamati kapsula bakteri anthrax, biasanya dengan menumbuhkan bakteri tersebut pada media yang diperkaya dengan serum atau 0,5% sodium bikarbonat dan diinkubasi dengan peningkatan 5 sampai 10 % CO2. Pembentukan kapsula bakteri menyebabkan koloni menjadi lebih halus, mukoid, konveks dan tepinya rata. Pertumbuhan bakteri anthrax pada media cair tidak menyebabkan kekeruhan tetapi teramati sebagai gumpalan yang mengapung dalam media dan teramati dapat naik atau turun ketika digoyangkan. Beberapa uji penting yang diperlukan untuk mengenal karakteri B.anthrax dan dapat dipakai sebagai pembeda terhadap bakteri anthracoid disarikan dalam table di bawah ini.

No

Properties

B.anthracis

Anthracoid

1

Motilitas

Non motil

Motil

2

Hemolisis pada PAD

Non hemolitik

Hemolitik

3

Kapsula

Terbentuk

Tidak ada

4

Kepekaan penisilin (0,5 unit/ml)

Peka

Resisten

5

Kepekaan gamma-phage

peka

Resisten

6

Hidrolisa gelatin

lambat

Cepat

7

Patogenisitas tikus dan marmut

patogenik

Non patogenik

.1. Uji Ascoli

Uji termopresipitasi Ascoli sangat berguna untuk menentukan jaringan tercemar Anthrax. Untuk uji Ascoli diperlukan serum presipitasi bertiter tinggi. Jaringan tersangka di-ekstrasi dengan air dengan cara perebusan, atau dengan penambahan kloroform. Cairan jernih yang diperoleh mengandung protein Anthrax, jika jaringan tersebut mengandung kuman Anthrax. Cairan tersebut disebut presiptinogen yang dipertemukan secara pelan-pelan dengan serum presipitasi (presipitin) dalam tabung sempit. Reaksi positif akan ditandai dengan terbentuknya cincin putih pada batas pertemuan antara kedua cairan tersebut.

Uji Ascoli digunakan untuk mendeteksi adanya antigen yang terdapat dalam sampel . Prinsip teknik ini reaksi antara antibodi (serum Ascoli) dengan antigen, di mana hasil positif akan terbentuk cincin warna putih di antara serum dan ekstrak sampel . Uji ini hanya baik digunakan untuk sampel dari hewan yang tersangka antraks dan tidak balk digunakan untuk sampel lingkungan, sebab terjadi reaksi silang dengan Bacillus lain .

Anthraxin merupakan antigen antraks yang diinaktivasi dan dimurnikan dan banyak digunakan dalam mengevaluasi vaksinasi dan studi retrospektif pada hewan dan manusia. Teknik ini diaplikasikan dengan cara menyuntikkan 0,1 ml Anthraxin secara

intradermal dan diamati dalam waktu 48 jam . Adanya pembengkakan dan kemerahan kulit menunjukkan reaksi positif (OIE, 2000).

Teknik PCR mulai digunakan secara luas untuk mendeteksi adanya gen factor virulensi (kapsul dan toksin PA). Jadi dalam hal ini dapat dipastikan suatu isolat adalah virulen atau tidak . Metode ini relatif cepat dengan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi (OlE, 2000; WHO, 1998) .

Teknik DFA juga dilaporkan mempunyai sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi . Uji ini dapat mendeteksi B. anthracis dalam waktu beberapa jam saja dan dapat membedakan B. anthracis dari Bacillus spp. lainnya . Uji ini mendeteksi 2 komponen dari B. anthracis, yaitu kapsul dan dindingnya . Uji ini menggunakan antibodi yang dilabel dengan Fluorescence lsothiocyanate (FITC). Teknik DFA yang mampu mendeteksi 2 komponen B. anthracis ini dilaporkan sensitif, spesifik dan merupakan uji konfirmatif yang cepat dan sangat berguna untuk mendeteksi B. anthracis secara langsung dari specimen lapangan (DE et al., 2002; OlE, 2000 ; WHO, 1998) .

Deteksi antigen yang lebih sensitif dan spesifik adalah dengan teknik immunochromatographic assay. Teknik ini menggunakan antibodi monoklonal anti-PA

yang dilekatkan pada membran nitroselulosa dan dapat mendeteksi adanya PA dalam sampel dengan jumlah yang sangat kecil yaitu 25 ng/ml (OlE, 2000 ; MULLER

et al., 2004) .

Enzyme linked immuno-sorbent assay (ELISA) digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi yang ada dalam sampel serum dan banyak digunakan untuk evaluasi vaksinasi, studi epidemiologi pada manusia, hewan ternak maupun hewan liar. Jika uji ini digunakan untuk diagnosa harus juga dilakukan pemeriksaan laboratorium yang lain (OIE, 2000 ;WHO, 1998).

Keterangan

B. anthracis mempunyai bentuk batang berantai wama biru dengan ujung siku-siku dengan kapsul berwama merah muda B. anthracis mempunyai bentuk koloni kasar, liat, warna abu-abu . non hemolisis, non motil dan membentuk spora Koloni B. Anthracis akan lisis jika ditetesi gamma-phage, pada umumnya B. anthracis sensitif terhadap penisilin Uji ELISA untuk deteksi antibodi anti-PA yang ada dalam sampel

serum . Jarang digunakan untuk diagnosis Untuk deteksi antigen B. anthracis . Pada uji ascoli terbentuk cincin putih diantara serum dan ekstrak sampel . Uji DFA untuk deteksi dinding sel dan kapsul (berwarna hijau jika dilihat di bawah

mikroskopfourescence). Pada uji immunochromatografic assay akan ada dua garis coklat pada kertas netroselulosa Untuk konfirmasi

Prosedur pemeriksaan

Isolasi dan identifikasi

Mikroskopik

Polvchrom methvlene blue

Visualisasi kapsul

Kultur

Morfologi koloni

Hemolisis

Motilitas

Sporulasi

Lisis gamma-phage

Sensitifitas terhadap penisilin

Deteksi antibodi

Uji Serologi : ELISA antibodi

Deteksi antigen

Uji ascoli

Direct Flourescence Assay (DFA)

Immunochromatoghrafic assay

Polvmerase Chain Reaction (PCR)

Hipersensitivity test (Anthraxin)

B. anthracis mempunyai bentuk batang berantai wama biru dengan ujung siku-siku dengan kapsul berwama merah muda B. anthracis mempunyai bentuk koloni kasar, liat, warna abu-abu . non hemolisis, non motil dan membentuk spora Koloni B. Anthracis akan lisis jika ditetesi gamma-phage, pada umumnya B. anthracis sensitif terhadap penisilin Uji ELISA untuk deteksi antibodi anti-PA yang ada dalam sampel

serum . Jarang digunakan untuk diagnosis Untuk deteksi antigen B. anthracis . Pada uji ascoli terbentuk cincin putih diantara serum dan ekstrak sampel . Uji DFA untuk deteksi dinding sel dan kapsul (berwarna hijau jika dilihat di bawah

mikroskopfourescence). Pada uji immunochromatografic assay akan ada dua garis coklat pada kertas netroselulosa Untuk konfirmasi virulensi, adanya dua pita yaitu PA (pXOI) dan kapsul (pXO2)

Suntikan intradermal 0,1 ml Anthraxin, diamati 48 jam pasca

suntikan, adanya pembengkakan dan kemerahan pada kulit

menunjukkan positif

20

Tidak ada komentar:

Posting Komentar